贯穿全生命周期营养的PQQ，其不同的生产工艺间有何区别

文/美琪健康

图源：摄图网

营养健康行业持续发展，全生命周期关键营养战略下，市场多元化原料持续发展。最近火爆国内外的新食品原料宠儿PQQ，以其超强的抗氧化性和多种健康益处，深受各大品牌商青睐。目前学术界已经相继在各领域权威期刊中发表最新研究成果，证明PQQ在抗氧化、线粒体保护及修复、器官及组织保护修复、促进生长发育和繁殖、预防老年痴呆、抗衰老、皮肤保护及修复，甚至作为哺乳动物辅酶发挥维生素作用等相关领域表现不凡。

1. PQQ的结构发现史 

PQQ学名为吡咯并喹啉醌二钠盐，全名为：4，5-二氢-4，5二氧-1-氢吡咯并(2，3-f)喹啉-2，7，9-三羧酸，但不要以为这是人工合成出来的物质，PQQ存在的历史甚至有可能比地球的年龄还要长，名副其实的“天外来客”，后来自然界的分解者-微生物通过进化也获得了合成代谢生成PQQ的能力，不得不感叹基因的伟大。 

直到20世纪六十年代，科学家才发现了PQQ的存在，通过大量的实验证明PQQ在微生物中是作为葡萄糖和甲醇脱氢酶有机辅酶发挥作用的，结构未知，只知道这种辅酶与蛋白的结合十分松散，并具有外分泌的特性，这也为21世纪通过微生物发酵生产PQQ 埋下了伏笔。大家不要小看这一发现，它不仅是发现了一种新的氧化还原酶辅酶那么简单，而是意味着酶学将出现一个新的分支：醌酶，即以PQQ和其它醌类化合物作为辅基的氧化还原酶类。在发现PQQ之前，人们曾认为氧化还原酶只有NAD/NADP和FAD/FMN两类辅基，遗憾的是PQQ是否参与哺乳动物电子传递链辅酶一直存在争议，相关研究也是在Nature期刊上吵得不可开交，大家谁也拿不出有力的证据驳斥对方，这也是为啥PQQ迟迟不能进维生素B族稳坐第十四把交椅的原因，这也为PQQ蒙上了一层神秘的面纱。 

直到1979年，美国科学家Salisbury和Westerling利用质谱和X衍射技术确认了PQQ结构，至此终见庐山真面目。目前确定PQQ 属于含氮醌类化合物，含有吡咯、喹啉环和醌式结构、并有 N-取代和三个羧酸结构(图1），因此命名为吡咯并喹啉醌。

从结构分析PQQ代表性的醌式结构决定了其有三种形态可以转化，一种是图1中的氧化态醌型（PQQ），一种是半醌型（PQQH）、最后一种是氢醌型（还原型），三种形态可以通过转移电子和质子互相转化，PQQ可以作为电子传递链上电子转移载体，从还原性物质上获得电子，并转移消除活性氧自由基，这就是PQQ能够连续进行抗氧化循环的原因所在,在这方面PQQ确实能够远超同类抗氧化物质（图2）。

由于PQQ本身含有三个羧基，导致其在水溶液状态下呈现弱酸性，通过在不同pH下结合不同摩尔比的钠离子，可以结晶析出得到PQQ、PQQNa、PQQNa2、PQQNa3四种成盐形式，其中以吡咯并喹啉醌二钠盐（PQQNa2）在食品领域应用最为广泛，主要是因为其具有良好的溶解性、吸收率及温和的pH范围。目前想要获得商业化的PQQ原料有两种方式：第一种是通过人工化学合成获得；另一种就是从自然界中筛选高产PQQ的菌株进行高密度发酵获得，下面也会就这两种生产工艺进行对比介绍。 

2. 有机化学合成法 

PQQ作为一种典型的有机物，本身的结构和分子量决定了其可以通过有限步骤的化学合成来得到。目前国内合成法PQQ已经通过了新食品申报，下图为公告内容节选（表1），工艺合成过程中使用了大量的自然界不存在的化工原料和中间体，成品质量标准中甚至出现了合成法带来的特有杂质。

在反应过程中使用了高危化学溶剂，整个合成路径中也必然会产生多种未知杂质（图3）。化学法过程中产生的杂质并不天然存在于人体体内，不排除在体内长期积累后带来危害的可能，此外使用化学法生产PQQ会对环境造成一定的污染。因此，化学合成法生产PQQ存在局限性。 

3. 微生物发酵法 

上文提到，自然界能合成PQQ的生物细菌，其中大多数是革兰氏阴性菌（表2），大部分细菌无法合成生命活动所必须的物质PQQ，只能通过外界摄入，高等动植物亦是如此，这就让PQQ在自然界显得十分“紧俏”且至关重要。 

随着现代发酵技术的不断进步，研究人员就自然而然想到能否通过选择合适的PQQ生产菌株，通过高密度发酵大量生成 PQQ，但是大家都知道PQQ本身就是一种在极微量条件下发挥作用的物质，想让菌大量生成PQQ并且按照人类的意愿把PQQ分泌出来，难度极大。 

办法揭秘之前，需要先来了解下微生物的合成途径究竟是什么样的。研究人员经过努力尽可能把PQQ合成编码基因家族发现完全，只不过每个基因具体作用是做什么的，目前认知有限，只知道缺少其中一个基因或多或少会影响PQQ的合成（表3）。

目前比较靠谱的路径叫做酪氨酸和谷氨酸的“艺术之旅”，首先，PqqA编码一条大约由23个氨基酸组成的含有保守谷氨酸和酪氨酸的多肽链作为PQQ合成的前体；随后，PqqA中的谷氨酸和酪氨酸残基在Ｓ－腺苷甲硫氨酸酶PqqE的作用下，通过C9和C9a的C-C键缩合形成中间底物。该缩合反应需要PqqD作为分子伴侣保护PqqA不被降解，并结合到活化的PqqE上，协助形成C-C键。接着，PQQ中间底物在蛋白酶PqqF的作用下，从PqqA中游离出来，形成仅含有谷氨酸和酪氨酸残基的PQQ骨架。最后，非常不稳定的PQQ骨架通过一系列的自发缩合和异构化反应形成中间产物AHQQ，AHQQ在PqqC的作用下通过八个电子的氧化反应以及环化形成PQQ上述基因是合成PQQ的必须基因。蛋白酶PqqF可由tldD等其他同源蛋白酶替代；而PqqB的功能并不确定，可能作为参与修饰PqqA的氧化酶，或作为将PQQ从细胞质运送至细胞间质的转运蛋白(图4）。整体生物合成路径较为复杂，让我们不得不感叹细胞工厂设计的精妙。

想获得商业化PQQ的办法就是在自然界中筛选安全可靠的菌株，这个菌株要满足以下几点要求：第一就是菌株的安全性要有保证，不能自带有毒有害代谢产物；第二就是PQQ合成表达量要大；第三点能够分泌到胞外，且发酵液上清要相对干净。

在十分苛刻的条件下，研究人员发现了甲基营养菌，比较有代表性的就是脱氮生丝微菌和食葡萄糖食甲基菌，其中脱氮生丝微菌应用最为广泛，为什么会选择它们呢？首先，这两株菌在生物安全性上经受住了检验。其次，甲基营养型菌株体内没有糖酵解途径，只有一碳化合物的直接氧化同化（甲醇、甲胺），恰巧这类代谢PQQ作为辅酶必不可少（图5），这样一来PQQ直接参与到了初级代谢中去，而且是关键的通路，且PQQ仅仅通过钙镁离子与酶中心松散连接，很容易脱落，可想而知这类菌株PQQ的表达量有多高。最后，这类菌株由于PQQ本身的分泌作用导致胞内数量不足，需要一直合成以弥补胞内PQQ的不足，这就是研究人员想看到的结果，整个培养过程中由于不需要加入有机氮源和糖类，就会避免了很多杂质和氨基酸的引入，减少了PQQ的胞外降解，也有利于下游提纯。

值得一提的是上述两种菌分别在欧美和国内获得报批许可，美琪健康目前通过自主筛选的上述两株菌株经过多年培育，配合优化后的发酵补料工艺胁迫产素，目前效价均已达到1000ug/ml以上的水平，且归一化纯度在70%以上，成品质量符合相关法规要求。 

4. PQQ的分离纯化 

PQQ无论是从合成法还是从发酵法制备，都不可避免面临提取纯化的问题，在这方面两种生产工艺对应的提取纯化倒是殊途同归，差别不大，只不过合成法受到杂质和溶剂等因素影响，工艺步骤繁琐一些。发酵法倒也不是一点劣势都没有，PQQ发酵液的稳定性较差，如果不能够及时处理，很快就会降解转化。

为了解决这个问题，美琪健康也在设备和工艺上下足了功夫，通过酸化和多级膜处理工艺，有效的解决了这个问题，后处理采用层析纯化和水相结晶的工艺，获得稳定的PQQ成品，满足更多应用可能。 

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