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营养在线 | 两篇NEJM论文:如何定义益生菌与活菌药物?

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文章来源:中国营养与健康

作者:向雪松,中国疾病预防控制中心营养与健康所副研究员。

毕玉晶,军事医学科学院微生物流行病研究所副研究员。

杨瑞馥,中国营养学会益生菌益生元与健康分会主任委员,军事医学科学院微生物流行病研究所研究员。

先有两篇Cell论文报道无效[1, 2],最近又有两篇NEJM论文报道治疗某些疾病未达预期效果[3, 4]。一些媒体就将这些论文误读为益生菌无效、甚至有害的结论。

我们有必要对这些论文的全文进行解读,并需要对益生菌和活菌药物的概念进行讨论。

Cell两篇论文用的菌(以色列一厂家产的Bio-25益生菌产品)是不符合益生菌的定义,而作者把益生菌写入题目而被误解;最近的两篇NEJM论文虽然用的是益生菌(Lactobacillus rhamnosus GG,Lactobacillus rhamnosus R0011和Lactobacillus helveticus R0052),但作者是评价它们作为活菌药物来治疗特定疾病,但却在题目或文中使用益生菌来代替“活菌药物”,也引起了一些媒体的误读。因此,我们需要重新认识“益生菌”和“活菌药物”的定义,以及它们的评价标准及应用范围。

益生菌

益生菌从广义角度理解,包括了狭义的益生菌和延伸特定医学应用的活菌药物,但是,随着人体微生物组与健康和疾病关系的揭示,我们有必要对益生菌与活菌药物进行严格的区分,以免名词使用上的混淆而导致媒体和公众对益生菌的误解。

益生菌定义及其评价标准

•2001年,世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对益生菌做了如下定义:益生菌是活的微生物,当摄入充足的数量时,对宿主产生健康益处。

•国际益生元与益生菌科学协会(ISAPP)在2014年发表的共识中继续认可FAO/WHO的定义,并强调了益生菌菌株鉴定和安全性评价的重要性。

•在ISAPP的共识中,发酵食品中的微生物不能直接称为益生菌,肠道中的有益菌、粪菌移植物及相关制品也未纳入当前益生菌概念。同时指出,以上食品或制品中的有益微生物,只有在进行分离鉴定、安全评价及功能试验之后符合益生菌概念的,才能称为益生菌。

从上述定义看,益生菌的概念应包含以下几个方面:

 益生菌必须是活的。这里的“活”是指益生菌在到达起效部位,即人体消化道不同起效部分时,依然是活的,而不仅仅是指生产出来的时候以及在产品中是活的状态;

 益生菌的作用与其剂量有关。只有达到了一定的数量才能起作用。所以,在考察一个益生菌的健康作用时,不能忽略其剂量;

 益生菌必须是对人体有用的。这是最重要的特征,一个微生物要最终能够称为益生菌,必须通过至少一个按照严格科学标准设计的人体临床试验证实;

 益生菌必须是安全的,意味着该微生物已经经过了严格的安全评价和研究验证(图1);

 国内外都有益生菌清单的规定,鉴于同一菌种不同菌株间的功能差异,国际上规定益生菌必须限定到株的水平,我国目前还没有这样严格的规定。

 图1. 国际益生菌协会(International Probiotic Association)评价标准示意图

活菌药物

活菌药物,也称为活菌制剂或活体生物药(LBP),是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂。

FDA给LBP的定义是:

 包含活的微生物如一些细菌;

 能够起到预防、治疗或治愈某种疾病;

 不是疫苗。

活菌药物主要是活性菌,同时也含有死菌及其代谢产物。活菌制剂可分为原生菌制剂和共生菌制剂,原生菌所使用的菌株来自于人体肠道内的原籍菌群,通过补充原生菌发挥作用,如双岐杆菌和乳杆菌等;共生菌制剂指菌株来自于人体肠道之外,与人体肠道细菌共生,能够促进人体细菌的生长与繁殖或直接发挥作用,如枯草芽孢杆菌等。

早期的第一代益生菌主要应用于食品,营养添加剂,大部分为乳酸杆菌属和双歧杆菌属。美国FDA还没有批准活菌药物上市,目前有20多家公司进行特定活菌生物药物研发,在研项目30多种。进度最快的已处于临床III期(SERES Therapeutics公司的SER-109项目,适应症为复发性难辨梭菌感染性腹泻)。国外已经对微生态相关药物(主要是益生菌和益生元)临床效果进行了循证评价并制定了应用指南[5]。表 1列出了基于证据的儿童用益生菌用于急性胃肠炎的研究及牛津循证医学中心证据等级(来源于世界胃肠病学组织的全球指导指南)。其中,LGG治疗急性胃肠炎的证据等级仅为1级,但被推荐;瑞氏乳杆菌R0052和鼠李糖乳杆菌R0011的证据等级为2级,但ESPGHAN/ESPID给出的结论是由于仅有一项RCT尚无足够证据形成推荐等级。

 表1  基于证据的用于儿童急性胃肠炎的益生菌

(表格来自世界胃肠病学益生菌益生元专家共识[5])
等级1:随机临床试验的系统性综述或者单病例随机对照试验;
等级2:显示益生菌疗效显著的临床水机试验或观察性试验;
等级3:非随机对照队列/随访研究;
等级4:基于系列、病例对照研究或者历史对照研究;
等级5:基于机制的推理。牛津循证医学中心“2011年证据等级”
(http://www.cebm.net/index.aspx?o=5653).

中国药典(2010版三部)中也有专门针对微生态活菌制品的论述。在这一版药典中,对于微生态活菌制品的基本要求包含了制品的制备方法、工艺能保证成品含有足够的活菌数量和稳定性,以及制品的安全性。实际上,中国药典里更多针对的是早些年已经上市的十几种微生态制剂,与现在FDA定义的活体生物药有一定的区别:

1)这类药物多为非处方药物,适应症大多是笼统的急慢性腹泻,并不明确;

2)当时国内临床试验标准不太完善、审批政策也较为宽松。国内近10年已无益生菌新菌株(种)用于药品,近8年无新品种上市。

因此,要与国际接轨,国内对于微生态制品的新药开发上,就必须要求有明确的适应症及临床效果评价,这也是微生态制剂作为活菌药物所必需的。

Cell论文所用菌株的性质

前段时间《细胞》杂志发表了以色列魏茨曼研究所的两篇研究论文[1, 2],分别提出益生菌仅在个别人的肠道里定植以及在抗生素使用后恢复肠道菌群紊乱过程中无效。以色列魏茨曼研究所使用的是以色列的一种叫做Bio-25的益生菌产品用来做研究。

我们对照上文益生菌的定义和评价标准,不难看出上述文章存在一些学术缺陷。

1.产品信息不全,该产品不能称为益生菌:以色列Supherb公司的Bio-25产品(至少250亿的活菌),文章中称包含11种细菌,但在论文材料方法中仅给出了10种细菌名称(B. bifidum, L. rhamnosus, L. lactis, L. casei, B. breve, S. thermophilus, B. longum sbsp. longum, L. paracasei, L. plantarum and B. longum sbsp. infantis),漏写了L. acidophilus,无论公司产品标签(https://www.supherb.co.il/en/it-works-naturally/probiotics-series/bio-25/)还是该篇论文中都没有菌株的编号以及混合比例等信息;

2.未检索到Bio-25产品的人体临床试验信息。反而在这两篇Cell文章中证实效果不显著,该论文结论恰好说明了虽然该产品声称很多临床功能,但经过初步临床实验证明该产品是无效的;

3.实验设计中存在的缺陷:
1)测试对象太少,不能代表一般人群,该实验招募的测试者仅8名年龄25-32岁的志愿者,需要年龄更广泛、更多的志愿者;
2)给予时间存在不足:该实验给予时间是在抗生素治疗后第7天,益生菌使用建议一般在抗生素治疗之前或同时使用;
3)观察指标不是益生菌作用特点:益生菌主要用于减少或预防抗生素相关性腹泻,该实验观察指标是抗生素使用后的菌群紊乱恢复情况;而且把益生菌的定植作为观察指标也是值得商榷的,因为没有检索到文献证据支持这些细菌对肠道上皮细胞的黏附作用。

NEJM论文所用菌株的性质

这两篇文章中提到的益生菌,一种是鼠李糖乳杆菌LGG株,另一种是鼠李糖乳杆菌R0011株和瑞氏乳杆菌R0052株的混合制剂。其中,鼠李糖乳杆菌(LGG®),是全球文献记录最完备的益生菌菌株。自1990年以来,鼠李糖乳杆菌已广泛用于食物和膳食补充剂,并且已在千余篇科学文献中有所介绍,在三百多个临床试验中进行了研究。美国食品药品监督管理局(FDA)已将LGG® 菌株列为公认的安全类添加剂(GRAS)。在欧洲,鼠李糖乳杆菌LGG®自2007年起就已获得了欧洲食品安全局(EFSA)授予的安全资格认定(QPS)。而另一种混合菌株制剂,早在1995年就已经被制成商品化的益生菌,其商品名称为LACIDOFIL®。根据各国现行法规,LACIDOFIL®已被注册为药品、保健食品及膳食补充剂等不同形式,主要为预防和治疗抗生素相关腹泻和儿科胃肠疾病等。目前已有二十多篇临床文献支持LACIDOFIL®所声称的功效:功效范围包括抗生素相关腹泻(AAD)、急性腹泻、治疗幽门螺杆菌感染、乳糖不耐症、肠应激综合征(IBS)、皮肤炎症、女性生殖系统菌群失调等等。在加拿大,LACIDOFIL®获得了卫生部批准的健康声称:帮助减少儿童及青少年AAD的风险。目前现有的文献对于这两种益生菌的产品的评价以一是安全的,二是针对某些特定人群和特定疾病有辅助作用。

以下是NEJM论文菌株在Clinical trial网上的信息:

1.其中一篇文章使用了上市的益生菌产品(Lacidofil Strong, Lallemand Health Solutions),是鼠李糖乳杆菌R0011株和瑞氏乳杆菌R0052株的混合制剂[4]。该益生菌产品在Clinical trial网上有2个相关研究信息(表2)

表2. Lacidofil Strong临床试验注册信息

2.另一篇文章使用的是益生菌产品L. rhamnosus GG (Chr. Hansen),是鼠李糖乳杆菌LGG株[3]。该菌产品在Clinical Trial网上有86条相关研究信息,涉及婴幼儿的42项,其中完成的28项,临床干预的24项。其中有3个研究与急性胃肠炎有关。美国的研究(表3中序号20)处于临床2期,发表了3篇相关文章,其中两篇介绍了实验方案[6, 7],目前刚刚发表的NEJM文章得到阴性结果,显示在患有急性胃肠炎的学龄前儿童中,接受5天的鼠李糖乳杆菌LGG株治疗与接受安慰剂的儿童效果相同[3]。

印度的研究(表3中序号22)处于临床1期,发表的文章证实对改善轮状病毒感染反复发作的腹泻和肠功能障碍有帮助,对隐孢子虫感染引起的肠通透性有改善作用[8]。

丹麦的研究(表3中序号10)发表文章表明,给婴幼儿(8-14个月)连续服用6个月的益生菌(Lactobacillus rhamnosus (LGG®) 和 Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12®),并没有改变婴幼儿肠道微生物群结构,说明益生菌的作用不一定是通过改变菌群结构发挥作用的[9]。

表3  Clinical Trial网站注册的有关
Lactobacillus rhamnosus GG的临床试

益生菌与活菌药物研究及应用建议

按照定义,益生菌需要经过体内外的实验证明其对人体有益的作用,如果声称对疾病的效果,需要正规注册的临床试验证据;且后者如果按照活菌药物研发要求申报药监局允许的临床试验,确实获得药监局批准后,方可作为活菌药物应用。

因此,我们建议二者的研发与应用应遵循如下规范:

1.益生菌需要有明确的来源,体内外功能验证数据齐全,至少有一个正规注册的临床试验的证据,且益生菌需要精确到株的水平,不能泛泛的指某个种;

2.NEJM的两篇报道,确实呈现了在治疗婴幼儿腹泻上是无效。因此,说明益生菌完全取代药物还需要更多研究去筛选的确有效的菌株;同时,我们也不能期望益生菌产品一定发挥治疗效果,即使应用的是目前所谓的“主流”益生菌产品;因此,在名词使用方面,只要是针对医学特定疾病治疗的益生菌应当成为活菌药物,而不能笼统地成为益生菌;

3.益生菌行业的蓬勃发展,需要更多的基础研究和临床数据,基础研究为临床应用指明方向,而临床观察反过来又印证基础研究的可信性,同时也确定其正确的应用方向;

4.益生菌有益但并不表明就是万用药,还需要扎实的临床数据佐证;

5.随着精准医疗时代的到来,益生菌也需要根据患者的实际肠道微生态状况,进行个性化定制;

6.活菌药物或称活菌制剂已有较长的研究历史,已有很多药监局注册上市的药物,各自有其适应症,实现治疗疾病的机理也不尽相同,对腹泻病而言,活菌药物可以通过降低肠道内氧分压和氧化还原电位、黏附到上皮细胞,排斥病原菌的黏附、产生细菌素,抗菌肽等抵抗致病菌、产生代谢产物(如丁酸等)强化肠上皮细胞屏障和免疫调节等作用来达到治疗腹泻的作用。因此,需要严格按照药品说明书应用是符合规范的;

7.随着肠道微生物组为代表的微生物组研究的进展,活菌药物的研究将成为新药研发的新热点,参考药监局对活菌制剂的研发要求,并依据对活菌药物的新要求(如对口服制剂而言,如何影响肠道微生物组的平衡等)发展新的评价方法,并形成对活菌药物新要求的共识,为活菌药物的研发奠定基础。

【参考文献】
1.  Zmora N, Zilberman-Schapira G, Suez J, Mor U, Dori-Bachash M, Bashiardes S, Kotler E, Zur M, Regev-Lehavi D, Brik RB, Federici S, Cohen Y, Linevsky R, Rothschild D, Moor AE, Ben-Moshe S, Harmelin A, Itzkovitz S, Maharshak N, Shibolet O, Shapiro H, Pevsner-Fischer M, Sharon I, Halpern Z, Segal E, Elinav E: Personalized Gut Mucosal Colonization Resistance to Empiric Probiotics Is Associated with Unique Host and Microbiome Features. Cell 2018, 174(6):1388-1405 e1321.
2.  Suez J, Zmora N, Zilberman-Schapira G, Mor U, Dori-Bachash M, Bashiardes S, Zur M, Regev-Lehavi D, Ben-Zeev Brik R, Federici S, Horn M, Cohen Y, Moor AE, Zeevi D, Korem T, Kotler E, Harmelin A, Itzkovitz S, Maharshak N, Shibolet O, Pevsner-Fischer M, Shapiro H, Sharon I, Halpern Z, Segal E, Elinav E: Post-Antibiotic Gut Mucosal Microbiome Reconstitution Is Impaired by Probiotics and Improved by Autologous FMT. Cell 2018, 174(6):1406-1423 e1416.
3.  Schnadower D, Tarr PI, Casper TC, Gorelick MH, Dean JM, O’Connell KJ, Mahajan P, Levine AC, Bhatt SR, Roskind CG, Powell EC, Rogers AJ, Vance C, Sapien RE, Olsen CS, Metheney M, Dickey VP, Hall-Moore C, Freedman SB: Lactobacillus rhamnosus GG versus Placebo for Acute Gastroenteritis in Children. N Engl J Med 2018, 379(21):2002-2014.
4.  Freedman SB, Williamson-Urquhart S, Farion KJ, Gouin S, Willan AR, Poonai N, Hurley K, Sherman PM, Finkelstein Y, Lee BE, Pang XL, Chui L, Schnadower D, Xie J, Gorelick M, Schuh S, Group PPT: Multicenter Trial of a Combination Probiotic for Children with Gastroenteritis. N Engl J Med 2018, 379(21):2015-2026.
5.  http://www.worldgastroenterology.org/guidelines/global-guidelines/probiotics-and-prebiotics/probiotics-and-prebiotics-mandarin.
6.  Freedman SB, Williamson-Urquhart S, Schuh S, Sherman PM, Farion KJ, Gouin S, Willan AR, Goeree R, Johnson DW, Black K, Schnadower D, Gorelick MH, Pediatric Emergency Research Canada Gastroenteritis Study G: Impact of emergency department probiotic treatment of pediatric gastroenteritis: study protocol for the PROGUT (Probiotic Regimen for Outpatient Gastroenteritis Utility of Treatment) randomized controlled trial. Trials 2014, 15:170.
7.  Schnadower D, Tarr PI, Casper TC, Gorelick MH, Dean MJ, O’Connell KJ, Mahajan P, Chun TH, Bhatt SR, Roskind CG, Powell EC, Rogers AJ, Vance C, Sapien RE, Gao F, Freedman SB: Randomised controlled trial of Lactobacillus rhamnosus (LGG) versus placebo in children presenting to the emergency department with acute gastroenteritis: the PECARN probiotic study protocol. BMJ Open 2017, 7(9):e018115.
8.  Sindhu KN, Sowmyanarayanan TV, Paul A, Babji S, Ajjampur SS, Priyadarshini S, Sarkar R, Balasubramanian KA, Wanke CA, Ward HD, Kang G: Immune response and intestinal permeability in children with acute gastroenteritis treated with Lactobacillus rhamnosus GG: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Clin Infect Dis 2014, 58(8):1107-1115.
9.  RP L, A L, KF M, MI B, TR L: Administration of two probiotic strains during early childhood does not affect the endogenous gut microbiota composition despite probiotic proliferation.%A Laursen MF. BMC microbiology 2017, 17(1):175.
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